scarabgenomics C-0742說明書

MDS™42 Chemically Competent Cell Kit

• 維持和繁殖不穩(wěn)定的克隆和質粒 - 攜帶直接重復序列，反向重復序列或導致明顯的二級“莖 - 環(huán)”結構的其他序列的pDNA載體在標準大腸桿菌宿主中通常是不穩(wěn)定的。CleanGenome® 大腸桿菌菌株經(jīng)常用于克隆在其他菌株中遭受不需要的重組事件的序列。
• 準確的質粒復制 - 從CleanGenome® 大腸桿菌菌株中刪除了重組或移動DNA元件，如插入元件，以確保您的構建體的忠實復制。
• 克隆和表達“有害”基因 - 清除Genome® 大腸桿菌菌株的自然防御系統(tǒng)，例如IS變異“有害”基因以阻止對生物體的壓力，已被刪除，因此它們不會干擾您的實驗。

背景

使用合成生物學方法，通過進行一系列計劃的，的缺失來減少大腸桿菌K-12基因組。多重缺失系列（MDS™）菌株（1），基因組減少高達15％，通過鑒定非必需基因和消除序列，包括重組或移動DNA和神秘毒力基因，同時保持強勁生長而設計和蛋白質生產(chǎn)?；蚪M減少還導致意想不到的有益特性，包括高電穿孔效率和重組基因和在其他菌株中不穩(wěn)定的質粒的準確繁殖。隨后的缺失和有用等位基因的引入產(chǎn)生適合于許多分子生物學應用的菌株。

圖1：多個缺失菌株耐受“有害”基因。 
由霍亂毒素B亞單位（CTX）融合的兔出血癥病毒VP60組成的嵌合基因在大腸桿菌中非常不穩(wěn)定。單獨地，兩個基因在E中都是穩(wěn)定的。大腸桿菌HB101，C600和DH10B，但在相同宿主中攜帶融合基因的pCTXVP60不產(chǎn)生融合蛋白，并且以低產(chǎn)率回收。所有回收的質粒都含有CTXVP60開放閱讀框中的突變，幾乎全部來自IS插入。相反，重組質粒在MDS TM中*穩(wěn)定; 獲得了正常的質粒DNA產(chǎn)量。pCTXVP60的代表性限制性模式。（A）將來自MDS TM 42的質粒DNA轉化并在的宿主中繁殖，然后用NcoI和EcoRI消化。純化每個限制性模式的代表并測序。M，分子量標記，1 kbp階梯; 1，MDS™41，無插入; 2，MDS™42，無插入; 3，DH10B，IS 10插入; 4，DH10B，IS 10插入/缺失; 5，C600，IS5插入; 6，C600，IS1插入; 7，C600，IS 1插入。（B）對于所呈現(xiàn)的五個實例確定的CTXVP60閱讀框中IS元件插入位點的相對位置。

圖2：不同宿主菌株中的質粒穩(wěn)定性。 
左：在pT-ITR的四次傳代培養(yǎng)期間，具有病毒LTR區(qū)段的質粒; 泳道0，傳代培養(yǎng)前分離的質粒DNA，泳道1-4，連續(xù)傳代培養(yǎng)。用限制酶消化質粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析。KpnI在單個位點切割質粒，但在MG1655中，兩個條帶表明質粒缺失。MscI在兩個位置切割，但在MG1655中，第三個中間帶確認質粒被刪除。右圖：慢病毒表達質粒的四種變體在MDS TM42ΔrecA和Stbl3 TM（Life Technologies）中的穩(wěn)定性，顯示含有完整質粒的轉化體的比例（表2 BioTechniques 43：466-470（2007年10月））（2）。

試劑盒組分 
MDS™42個化學感受態(tài)細胞
的pUC19對照DNA（10微克/微升）
的SOC培養(yǎng)基

基因型 
MG1655多缺失菌株（1）
所述的recA基因 1819突變是Δ的*缺失的recA。
已經(jīng)在基因組中產(chǎn)生了lacZ M15缺失，以允許使用β-半乳糖苷酶的α-互補片段對質粒中的插入物進行藍/白篩選。

質量控制 
使用pUC19對照DNA測試轉化效率，一式兩份進行。將轉化的細胞接種在含有50μg/ ml羧芐青霉素的LB平板上。轉化效率= 1×10 ⁸cfu /μgDNA。

儲藏條件 
將組件儲存在-80°C。不要將細胞儲存在液氮中。

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