單位定義：

• 一個(gè)單位的 TGIRT ® -III 逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT) 活性是使用 poly(rA)/oligo(dT) 42作為底物在 60°C 下在 1 分鐘內(nèi)聚合 1 nmole dNTP 所需的酶量。

酶濃度：

• 200 單位/微升

酶儲(chǔ)存緩沖液：

• 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、500 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、50% 甘油

酶特性和新活性：

• 比逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶具有更高的熱穩(wěn)定性、持續(xù)合成能力和保真度，允許從高度結(jié)構(gòu)化或高度修飾的 RNA （例如 tRNA）和包含富含 GC 重復(fù)擴(kuò)增的 RNA合成全長(zhǎng)、端到端的 cDNA 。1-9,12,15,18

• 新型端到端模板轉(zhuǎn)換活動(dòng)，可在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中連接 RNA-seq 或 PCR 接頭，無(wú)需單獨(dú)的 RNA 3'-接頭連接步驟。1這種模板轉(zhuǎn)換活動(dòng)極大地促進(jìn)了鏈特異性 RNA-seq 文庫(kù)的構(gòu)建，與使用隨機(jī)六聚體引物或使用 RNA 連接酶進(jìn)行接頭連接的程序相比，偏差更小。1,7,8

• 從退火引物高效合成 cDNA。退火引物的預(yù)測(cè) T m應(yīng)大于 60 o C。建議將酶與反應(yīng)混合物中的底物在室溫下預(yù)孵育 30 分鐘，并通過(guò)添加 dNTP 開(kāi)始反應(yīng)。新應(yīng)用的最佳條件應(yīng)通過(guò)測(cè)試 25 至 450 mM NaCl 的鹽濃度范圍來(lái)確定。

酶的建議用途：

1. 全面的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組分析。8

2. 全細(xì)胞、外泌體、血漿和其他無(wú)細(xì)胞 RNA 的 RNA-seq。7、8、15

3. miRNA、tRNA 和其他小的非編碼 RNA 的分析。1-9,12,15

4. RIP-seq、HITS-CLIP、irCLIP 和 CRAC，??用于表征 RNA-蛋白質(zhì)相互作用和核糖體分析。1,10,11

5. 通過(guò)高通量測(cè)序鑒定 RNA 堿基修飾。4、5、13、14

6. 使用 SHAPE 和 DMS 修飾等方法進(jìn)行全基因組或靶向 RNA 結(jié)構(gòu)映射。1,16

7. 富含 GC 的重復(fù)擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄和定量。18

8. 長(zhǎng) cDNA 的合成。1

9. RT-qPCR。1

10. 單鏈 DNA 序列。17

11. FFPE腫瘤樣本分析（咨詢(xún)InGex技術(shù)支持）。

酵素的優(yōu)點(diǎn)：

1. 全面的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組分析。

與非鏈特異性 TruSeq v2 相當(dāng)且優(yōu)于鏈特異性 Tru-Seq v3，TGIRT®-seq 的 ribodepleted、碎片化通用人類(lèi)參考 RNA 樣本概括了人類(lèi)轉(zhuǎn)錄本和摻入的相對(duì)豐度。TGIRT®-seq 明顯比 TruSeq v3 更具鏈特異性，并消除了 TruSeq 固有的隨機(jī)六聚體引發(fā)的采樣偏差。與 TruSeq 相比，TGIRT®-seq 顯示出更均勻的 5' 到 3' 基因覆蓋并識(shí)別出更多的剪接點(diǎn)。TGIRT®-seq 能夠同時(shí)分析同一 RNA-seq 中的 mRNA 和 lncRNA 作為結(jié)構(gòu)化的小 ncRNA，包括 TruSeq 數(shù)據(jù)集中基本上不存在的 tRNA。8

2. 全細(xì)胞、外泌體、血漿和其他細(xì)胞外 RNA 的 RNA-seq。

快速處理時(shí)間（通過(guò) PCR 步驟構(gòu)建 RNA-seq 文庫(kù)<5 小時(shí)）；需要少量 RNA（低 ng 范圍）；全面的轉(zhuǎn)錄譜，包括 mRNA 和 lncRNA 以及小 ncRNA，包括 tRNA、pre-miRNA 和其他結(jié)構(gòu)化小 ncRNA 的全長(zhǎng)讀數(shù)；比傳統(tǒng)方法更少的偏見(jiàn)和更高的鏈特異性。7、8、15

3. 在 RIP-seq、HITS-CLIP、irCLIP、CRAC、核糖體分析等方法中，通過(guò) TGIRT® 模板切換構(gòu)建 RNA-seq 文庫(kù)。

快速處理時(shí)間（通過(guò) PCR 步驟構(gòu)建 RNA-seq 文庫(kù)<5 小時(shí)）；需要少量 RNA（低 ng 范圍）；不需要 RNA 連接酶，程序中的步驟更少，偏差更小，效率更高。1,10,11

4. 比逆轉(zhuǎn)錄病毒 RT 具有更高的熱穩(wěn)定性、持續(xù)合成能力和鏈置換活性。

• 使用錨定 oligo(dT) 引物構(gòu)建多腺苷酸化 RNA 的 RNA-seq 文庫(kù)，其 5' 到 3' 覆蓋率比沒(méi)有核消耗步驟的逆轉(zhuǎn)錄病毒 RT 更均勻。1
• 通過(guò)毛細(xì)管電泳的基于的方法狀或DMS結(jié)構(gòu)映射以使RNA結(jié)構(gòu)映射顯著升onger閱讀長(zhǎng)度和過(guò)早停止比逆轉(zhuǎn)錄病毒RT更少。1,16
• 能夠分析包含富含 GC 的重復(fù)擴(kuò)增的 RNA 模板。18
• 能夠從 tRNA 和其他小型結(jié)構(gòu)化/修飾的 ncRNA 合成全長(zhǎng)、端到端的 cDNA，這些 ncRNA 對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒 RT 無(wú)效。4-9,12-15     

5. 人血漿和大腸桿菌 基因組DNA 的ssDNA-seq 。

通過(guò)直接在 DNA 鏈的 3' 末端啟動(dòng) DNA 合成，同時(shí)連接 DNA-seq 接頭，無(wú)需末端修復(fù)、拖尾或連接，從而以更簡(jiǎn)單的工作流程捕獲精確的 DNA 末端。能夠分析核小體定位、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、DNA 甲基化位點(diǎn)和起源組織。17