celldatasci使命是使用先進(jìn)的分子分析技術(shù)來(lái)挑戰(zhàn)生物樣本，并加強(qiáng)基礎(chǔ)科學(xué)和個(gè)性化醫(yī)療的關(guān)鍵遺傳和基因組數(shù)據(jù)的恢復(fù)。

celldatasci RNAstorm說(shuō)明書(shū)

The RNAstorm™ Kit - Powerful RNA extraction from FFPE samples

RNAstorm™試劑盒 - 從FFPE樣品中提取強(qiáng)大的RNA

福爾馬林固定的組織樣品是RNA提取的挑戰(zhàn)，通常導(dǎo)致可擴(kuò)增的RNA的低產(chǎn)率和在涉及酶操作的后續(xù)步驟中的差的性能，包括逆轉(zhuǎn)錄和測(cè)序文庫(kù)制備。

RNAstorm™提取試劑盒采用專(zhuān)有的CAT5™技術(shù)，可增強(qiáng)甲醛誘導(dǎo)損傷的去除，并為RNA提供更高的產(chǎn)量和質(zhì)量，更好的完整性和更高的可擴(kuò)增性。該技術(shù)由Cell Data Sciences研究人員開(kāi)發(fā)，基于斯坦福大學(xué)開(kāi)展的研究，并于2015年在Nature Chemistry上發(fā)表。

無(wú)論您是進(jìn)行RNA-seq，qPCR，微陣列還是其他基因表達(dá)分析，RNAstorm™試劑盒都是您獲得成功的適合機(jī)會(huì)。

一個(gè)簡(jiǎn)單方便的工作流程

RNAstorm試劑盒為從FFPE樣品中提取高產(chǎn)量和高完整性RNA提供了便利的工作流程。

該試劑盒還可與DNAstorm™試劑盒結(jié)合使用，從同一組織切片中獲得純DNA和RNA。

可擴(kuò)增RNA的產(chǎn)量更高

使用來(lái)自各種組織的FFPE樣品的RNAstorm™試劑盒可以看到RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的顯著改善（通過(guò)可擴(kuò)增RNA的量來(lái)衡量），其年齡范圍從1976年到2015年。

NormalLiver 1NormalLiver 2NormalKidneyRenal CellCarcinomaColorectalCancer 1ColorectalCancer 20102030Fold increase in RNA amountRNAstorm™ KitKit Q

通過(guò)FFPE組織的定量RT-PCR比較RNA回收率。“Q”代表競(jìng)爭(zhēng)性商業(yè)FFPE提取試劑盒。

更高完整性RNA

NormalLiver 1NormalLiver 2NormalKidneyRenal CellCarcinomaColorectalCancer 1ColorectalCancer 2020406080DV200 (%)RNAstorm™ KitKit Q

對(duì)于使用RNAstorm TM試劑盒提取的RNA相對(duì)于流行的商業(yè)試劑盒，觀察到增加的DV ₂₀₀值。DV ₂₀₀表示使用Agilent Bioanalyzer RNA 6000納米試劑盒測(cè)量的長(zhǎng)度大于200nt的RNA的百分比。

使用來(lái)自RNAstorm TM試劑盒和試劑盒Q所見(jiàn)的相同樣品的RNA獲得的BioAnalyzer痕跡的示例性疊加顯示如下。

經(jīng)常問(wèn)的問(wèn)題

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA中是否存在任何污染的基因組DNA？

基因組DNA的污染是一個(gè)很大的問(wèn)題，因?yàn)樗梢愿蓴_下游應(yīng)用。RNAstorm™試劑盒包括優(yōu)化的DNase消化步驟，可去除污染的基因組DNA，而不會(huì)顯著影響RNA產(chǎn)量。雖然此步驟是可選的，但強(qiáng)烈建議您這樣做。

我可以從FFPE樣本中獲得多少RNA？

影響獲得的RNA總量的大變量是樣品本身的質(zhì)量（即組織的類(lèi)型和數(shù)量，以及分離和保存樣品時(shí)的護(hù)理）。使用RNAstorm™試劑盒，并假設(shè)至少合理的樣品質(zhì)量，可以獲得大于1微克的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用于RNA-Seq嗎？

是。只要RNA具有足夠高的質(zhì)量，就可以獲得高質(zhì)量的文庫(kù)。對(duì)于Illumina測(cè)序，建議使用至少30％的DV200，并且應(yīng)使用提供至少1μgRNA的樣品。

如何準(zhǔn)備組織？

使用切片機(jī)從FFPE樣品中獲得5-10μm切片。如果可以可靠地切割，則可以使用厚度小于5μm的部分。建議不要使用厚度超過(guò)10微米的部分，因?yàn)樗鼈兛赡軣o(wú)法*消化。此外，每次提取應(yīng)使用不超過(guò)5個(gè)部分（每個(gè)10μM）。使用過(guò)多的組織會(huì)導(dǎo)致消化不*并降低產(chǎn)量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們建議機(jī)械研磨相當(dāng)于推薦部分?jǐn)?shù)量的組織。

我可以使用FFPE核心嗎？

是的，可以使用FFPE核心。由于核心不使用切片機(jī)進(jìn)行處理，因此如果觀察到不*消化，則推薦樣品消化更加困難并且建議進(jìn)行機(jī)械均質(zhì)化（例如使用鋼珠）。

你推薦哪種脫蠟方法？

RNAstorm™試劑盒包括推薦的Deparaffinization Reagent。與其他常用方法（例如二甲苯）不同，脫石蠟試劑是，無(wú)毒的，不需要使用通風(fēng)櫥。在我們的測(cè)試中，所包含的試劑在去除石蠟和允許純化高質(zhì)量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

定量從FFPE樣品中獲得的RNA的適合方法是什么？

源自FFPE的RNA比從新鮮樣品獲得的RNA更準(zhǔn)確地定量。僅知道RNA的量是否足夠，以及RNA是否適用于下游應(yīng)用，這取決于以下因素：

• 片段大小分布：如果RNA-Seq由<200nt的片段組成，則5μg樣品（通過(guò)Qubit測(cè)量）對(duì)RNA-Seq無(wú)用。
• 化學(xué)修飾：對(duì)于從福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA，各種化學(xué)加合物和交聯(lián)（包括堿基修飾，堿基交聯(lián)和堿 - 蛋白質(zhì)交聯(lián)）可使核酸分子不能被酶接近，因此在下游應(yīng)用中無(wú)活性。
• 污染：純化過(guò)程中使用的細(xì)胞碎片，蛋白質(zhì)，鹽和清潔劑可能會(huì)影響下游檢測(cè)。例如，基于UV / Vis的方法如Nanodrop特別容易受到在200-280nm范圍內(nèi)吸收的污染物的影響。
• 基于熒光的方法如Qubit容易出現(xiàn)明顯錯(cuò)誤。使用低濃度的DNA或RNA時(shí)，基于染料的檢測(cè)可能不是線(xiàn)性的。還必須注意RNA樣品中基因組DNA的污染，因?yàn)橛糜跓晒舛康娜玖喜⒉?特異于FFPE衍生的DNA或RNA。
• 定量PCR是定量嚴(yán)重受損和修飾的核酸的優(yōu)選方法。

RIN編號(hào)是否應(yīng)用于確定FFPE衍生RNA的質(zhì)量？

雖然RIN數(shù)可以提供有關(guān)樣品碎片程度的一般信息，但它不是敏感或可預(yù)測(cè)的，不足以成為下游性能的有用指標(biāo)，特別是對(duì)于RNA-Seq。通常，F(xiàn)FPE衍生的RNA的RIN數(shù)字將在2到3之間。這些樣本中的一些將用于RNA-Seq，而其他樣本則不會(huì)--RIN不會(huì)告訴您。

使用Illumina測(cè)序在RNA-Seq中稍微更好的預(yù)測(cè)性是DV200，其代表長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸的RNA片段的百分比。DV200也是基于Bioanalyzer數(shù)據(jù)計(jì)算的，但是存在與所有基于生物分析儀的方法相同的缺點(diǎn)，特別是高變異性。

從FFPE樣品中提取RNA時(shí)我需要知道什么？

• 避免使用基于有機(jī)溶劑的方法（Trizol）
• 避免使用刺激的離液鹽（即胍鹽）
• 避免使用UV和/或Qubit影響下游定量的洗滌劑（例如Triton X-100）
• 不要依賴(lài)RIN來(lái)定量FFPE衍生樣品的完整性?？纯礊槭裁础Ｕ?qǐng)改用DV200。
• 使用從福爾馬林中去除化學(xué)修飾的試劑盒或方法。不要將溫度升至80?C或更高。即使在此溫度下短時(shí)間也會(huì)顯著降低完整性。
• 警惕Qubit和Nanodrop濃度，因?yàn)橛锌赡鼙挥袡C(jī)分子或DNA污染。
• 使用qPCR定量RNA，并始終仔細(xì)查看解鏈曲線(xiàn)，以確定是否可能發(fā)生非特異性擴(kuò)增。