myPOLS Biotec是一家來自康斯坦茨大學的生物技術(shù)公司，來自Andreas Marx教授的研究小組。憑借我們在高通量DNA聚合酶設(shè)計方面的專業(yè)知識，我們?yōu)槟膽?yīng)用定制酶。
myPOLS Biotec正在開發(fā)新一代的DNA聚合酶
用于和可靠的應(yīng)用，例如個性化醫(yī)療，病原體檢測，DNA和RNA診斷，法醫(yī)學等等。
我們的研發(fā)活動包括：
后但并非不重要：我們所有的酶和混合物都是在康斯坦茨內(nèi)部生產(chǎn)的，并經(jīng)過常規(guī)測試，符合高質(zhì)量標準。
Article | Product | Size |
#7101S | VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix (including separate lysis buffer) | 100 reactions à 25 µl, 1 x 1.25 ml |
#7101M | VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix (including separate lysis buffer) | 500 reactions à 25 µl, 5 x 1.25 ml |
該混合物專門針對直接從電池應(yīng)用進行了優(yōu)化。
省略耗時且昂貴的RNA純化。VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix使您能夠直接從細胞懸液或細胞裂解液中定量和檢測RNA，無需純化步驟。只需將細胞分離，將細胞懸浮液直接添加到RT-PCR反應(yīng)混合物中，放入實時儀器中，然后啟動。
任選地，使用裂解緩沖液直接在孔或燒瓶中裂解細胞，簡單地旋轉(zhuǎn)并將上清液直接加入到RT-PCR混合物中。 - 準備好了。
裂解物也可以冷凍并儲存在-20℃。
應(yīng)用
VolcanoCell2G可以直接從細胞中進行靈敏的RNA檢測：
一個） |
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b） |
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圖1. 直接來自細胞RT-qPCR的0步驟 a）直接來自細胞RT-qPCR的0步驟的工作流程比2步驟標準RT-qPCR更容易和更快。b）從Lund人中腦（LUHMES）細胞中檢測到GAPDH mRNA，其根據(jù)VolcanoCell2G方案（包括單獨的裂解緩沖液）重懸浮。 |
反應(yīng)設(shè)置
零件 | 卷 | 終濃度 |
VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix | 12.5μl | 1X |
引物前移（10μM）* | 1μl | 0.4μM（0.05-1μM） |
引物反向（10μM）* | 1μl | 0.4μM（0.05-1μM） |
探針（10μM） | 1μl | 0.4μM（0.05-1μM） |
模板**： 細胞懸浮液（無核酸酶水）*** 要么 細胞裂解液（在1x裂解緩沖液中）*** |
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不含核酸酶的水 | 總反應(yīng)體積高達25μl |
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將所有組件保存在冰上。
在使用前仔細旋轉(zhuǎn)并混合所有溶液。
*請注意，Volcano RT-PCR混合物是從DNA和RNA模板擴增的，因此必須使用僅與外顯子 - 外顯子連接結(jié)合的RNA選擇性引物。
**建議的細胞數(shù)是懸浮在無核酸酶水或1x VolcanoCell2G裂解緩沖液中的10-10,000個細胞。細胞懸浮液應(yīng)按照隨附手冊的“方法”部分的建議進行新鮮制備。
***細胞培養(yǎng)的模板可直接通過在無核酸酶水中稀釋細胞沉淀（產(chǎn)品手冊的METHODS部分中的方案1）或通過用1x VolcanoCell2G裂解緩沖液裂解孔或管中的細胞來制備（方案2）在產(chǎn)品手冊的METHODS部分中，當需要從不同的孔（例如：在微量滴定板上）制備RT-PCR反應(yīng)時，這對于高通量測定可能更有用。
典型的0步RT-PCR方案（不需要等溫逆轉(zhuǎn)錄步驟）
步 | 溫度 | 時間 |
初始變性 | 95℃ | 3分鐘 |
變性 | 95℃ | 15秒 |
退火/延伸* | 55-75℃下 | 60秒（25-40周期） |
保持 | <10℃ | 保持 |
*通常，退火溫度比所用引物的計算熔融溫度低約3-5℃。通過運行溫度梯度理想地建立新的PCR，以便找到每個引物對的宜退火/延伸溫度。還可以應(yīng)用三步協(xié)議，具有單獨的退火和延伸步驟。
該試劑盒包含一種工程化，極熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶和組合的DNA聚合酶，包括一個特別優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)，只需要少量細胞（100到10,000個細胞）。套件中還包含單獨的裂解緩沖液。
所包含的Volcano2G DNA聚合酶通過多代定向人工進化而設(shè)計，并且在95℃下的半衰期> 40分鐘。它直接從細胞懸浮液或裂解物中促進“零步”RT-PCR，無需等溫逆轉(zhuǎn)錄步驟。
VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix包含所有標準實時循環(huán)儀器中成功可靠的RT-PCR所需的所有組分，并且與常見的RT-PCR檢測方法兼容，如熒光實時PCR染料或熒光探針。
推薦的擴增子大小應(yīng)在60-300 bp之間。?
請注意，必須使用跨越外顯子 - 外顯子連接的引物，以限制僅對mRNA靶標的擴增。
通過避免昂貴，耗時的細胞裂解或RNA純化，VolcanoCell試劑盒是高通量應(yīng)用，RNAi敲除或基因表達實驗的理想選擇。預先準備好的2x混合物可確?？芍貜偷腞T-PCR結(jié)果，顯著縮短設(shè)置時間和移液錯誤的風險。只需添加引物和模板。用包含的裂解緩沖液可以容易地制備細胞裂解物。但是，擴增子的大小宜在60-300 bp之間！
VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix含有工程DNA聚合酶，在具有dNTP的應(yīng)用優(yōu)化緩沖系統(tǒng)中具有逆轉(zhuǎn)錄活性。還包括單獨的裂解緩沖液。
RT-PCR活性：測試VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix的成功RT-PCR性能。在實時PCR循環(huán)儀中從人總RNA提取物擴增151bp片段（HPRT1 mRNA），并將其顯示為單一擴增產(chǎn)物。
DNA聚合酶活性：已經(jīng)使用人工DNA模板和DNA引物監(jiān)測Volcano2G聚合酶活性并將其調(diào)整為特定的DNA聚合酶活性。
通過蛋白質(zhì)特異性染色確定酶濃度。有關(guān)批次特定濃度，請通過info@mypols.de查詢更多信息。
本產(chǎn)品采用冷藏包裝。請在抵達-20°C時存放產(chǎn)品。通過以等分試樣存儲來小化凍融循環(huán)的次數(shù)。對于日常使用，我們建議將等分試樣保持在4°C。
Chovancova，P.，Merk，V.，Marx，A.，Leist，M.，Kranaster，R。（2017）反向轉(zhuǎn)錄定量PCR直接來自沒有RNA提取且沒有等溫逆轉(zhuǎn)錄的細胞：'零步'RT-qPCR協(xié)議。Biol Methods Protoc（2017）2（1）：bpx008。doi：https：//doi.org/10.1093/biomethods/bpx008
Blatter，N.，Bergen，K.，Nolte，O.，Welte，W.，Diederichs，K.，Mayer，J.，Wieland，M。和Marx，A。（2013），RNA的結(jié)構(gòu)和功能 - 閱讀耐熱DNA聚合酶。Angew。化學。詮釋。Ed。，52：11935-11939。DOI：10.1002 / anie.20130665。
Kranaster，R.，Drum，M.，Engel，N.，Weidmann，M.，Hufert，F(xiàn)T和Marx，A。（2010），一步RNA病原體檢測，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的突變熱穩(wěn)定Thermus aquaticus DNA聚合酶。Biotechnology Journal，5：224-231。DOI：10.1002 / biot.200900200。
貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
8100S | Volcano2G DNA聚合酶 | 250 U，5U /μl，50μl | mypols |
8100M | Volcano2G DNA聚合酶 | 1000U，5U /μl，200μl | mypols |
6101S | Volcano3G RT-PCR Probe 2x Master Mix | 100 reactions á 25 µl | mypols |
1 x 1.25 ml | mypols | ||
6101M | Volcano3G RT-PCR Probe 2x Master Mix | 500 reactions á 25 µl | mypols |
5 x 1.25 ml | mypols | ||
6201S | Volcano3G RT-PCR Probe 2x Master Mix (+ROX) | 100 reactions á 25 µl | mypols |
1 x 1.25 ml | mypols | ||
6301S | Volcano3G RT-PCR Probe 2x Master Mix (+GreenDye) | 100 reactions á 25 µl | mypols |
1 x 1.25 ml | mypols | ||
6401S | Volcano3G RT-PCR Probe 2x Master Mix (+GreenDye, +ROX) | 100 reactions á 25 µl | mypols |
1 x 1.25 ml | mypols | ||
7101S | VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix (including separate lysis buffer) | 100 reactions à 25 µl, 1 x 1.25 ml | mypols |
7101M | VolcanoCell2G RT-PCR 2x Master Mix (including separate lysis buffer) | 500 reactions à 25 µl, 5 x 1.25 ml | mypols |
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